TCVN 13917-3:2023 phát hiện và định lượng thực vật biến đổi gen- ngô chuyển gen MON 88017

Ngô biến đổi gen (bắp) là một loại cây trồng biến đổi gen. Các giống ngô cụ thể được biến đổi gen để thể hiện đặc điểm mong muốn về mặt nông nghiệp, bao gồm khả năng kháng sâu bệnh và thuốc diệt cỏ.

Các giống ngô có cả hai đặc điểm này hiện đang được sử dụng ở nhiều quốc gia. Ngô biến đổi gen cũng gây ra nhiều tranh cãi về tác động có thể xảy ra đối với sức khỏe, tác động đến các loài côn trùng khác và thực vật khác thông qua dòng gen.

Hiện nay, quy định về cây trồng biến đổi gen khác nhau giữa các quốc gia, với một số khác biệt rõ rệt tùy vào mục đích sử dụng. Có một sự đồng thuận khoa học rằng thực phẩm hiện có có nguồn gốc từ cây trồng biến đổi gen không gây ra rủi ro lớn hơn cho sức khỏe con người so với thực phẩm thông thường nhưng mỗi loại thực phẩm biến đổi gen cần được thử nghiệm và đánh giá mức độ rủi ro đối với môi trường và phải đảm bảo quy định về dán nhãn đối với thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen trên cơ sở từng trường hợp cụ thể trước khi đưa vào sử dụng.

Tại Việt Nam, các quy định liên quan đến vấn đề quản lý sản xuất và sử dụng sản phẩm biến đổi gen cũng đã được ban hành. Ngoài ra để đảm bảo kiểm soát tốt vấn đề này cần có quy trình phát hiện sản phẩm biến đổi gen phù hợp với tiêu chuẩn của Việt Nam và quốc tế.

Hiện nay Bộ Khoa học và Công nghệ đã ban hành Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13917-3:2023 về phát hiện và định lượng thực vật biến đổi gen – phần 3 sự kiện ngô chuyển gen MON 88017 (ngô chống chịu thuốc trừ cỏ gốc Glyphosate và kháng sâu hại rễ ngô) nhằm đưa ra phương pháp real-time PCR (phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực) để phát hiện và định lượng sự kiện MON 88017 (Zea mays L) trong cây ngô và sản phẩm có nguồn gốc từ ngô.

Phương pháp real-time PCR là quy trình enzyme kết hợp khuếch đại in vitro các đoạn ADN đặc hiệu với việc phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu trong quá trình khuếch đại. ADN (Axit deoxyribonucleic) polymer của các deoxyribonucleotide dạng sợi đôi hoặc sợi đơn là chất mang thông tin di truyền, được mã hóa theo chuỗi các base (hợp chất vòng nitơ có trong purin hoặc pyrimidin) có trong nhiễm sắc thể và vật liệu nhiễm sắc thể của các bào quan.

 Để phát hiện sự kiện ngô chuyển gen MON 88017 các đường khuếch đại real-time PCR cần được kiểm tra trực quan về hình dạng. (Ảnh minh họa)

Về nguyên tắc phát hiện trình tự ADN đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MON 88017 có kích thước 95 bp bằng real-time PCR. Định lượng hàm lượng ADN sự kiện ngô chuyển gen MON 88017, sử dụng đồng thời với các mồi và đoạn dò đặc hiệu taxon để khuếch đại đoạn 79 bp của gen hmg trong các vật liệu ngô chuẩn và mẫu thử nghiệm.

Các sản phẩm PCR tích lũy được đo ở mỗi chu trình (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu trình tự đích được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang FAM và TAMRA. Lưu ý FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang.

Yêu cầu chung về thuốc thử, đối với chất lượng thuốc thử được sử dụng trong TCVN 7608 (ISO 24276). Thuốc thử phân tích phải là loại tinh khiết thích hợp dùng cho sinh học phân tử, không chứa ADN và DNAse. Sử dụng thuốc thử phải tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nước, nước cất hai lần, nước đã khử ion hoặc nước có chất lượng tương đương.

Yêu cầu chung sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm sinh học phân tử trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác gồm máy ly tâm, tốc độ quay từ 6 000 rpm /min đến 12 000 rpm /min. Máy chu trình nhiệt real-time. Thiết bị khuếch đại ADN in vitro và thực hiện các chu trình nhiệt độ-thời gian cần thiết cho PCR.

Ngoài ra, máy phải có khả năng kích thích phân tử huỳnh quang ở các bước sóng quy định và phát hiện đủ ánh sáng huỳnh quang phát xạ của chất đánh dấu huỳnh quang được dùng để thực hiện các phân tích định dạng. Ống phản ứng, phù hợp với mỗi máy chu trình nhiệt real-time.

Đối với hạt ngô và sản phẩm từ ngô nên lấy mẫu theo TCVN 9027 (ISO 24333). Đối với các sản phẩm khác, lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể có liên quan. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này. Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện, mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Cách tiến hành thiết lập real-time PCR bằng cách chuẩn bị real-time PCR cho trình tự đích đặc hiệu taxon hmg và trình tự đích đặc hiệu MON 88017 phải được thực hiện trong các ống riêng biệt. Thuốc thử phải được rã đông hoàn toàn ở nhiệt độ phòng. Mỗi loại thuốc thử phải được trộn cẩn thận và ly tâm (trong thời gian từ 20 giây đến 30 giây ở tốc độ từ 6000 rpm trở lên) trước khi lấy bằng pipet. Hỗn hợp thuốc thử PCR được chuẩn bị có chứa tất cả thành phần trừ ADN mẫu thử.

Tổng lượng hỗn hợp thuốc thử PCR cần được chuẩn bị phụ thuộc vào số phản ứng cần thực hiện, bao gồm ít nhất thêm một phản ứng cho mỗi lượng 10 phản ứng cần thực hiện để dự phòng cho phản ứng bổ sung. Số lượng mẫu thử và các phép kiểm chứng lặp lại theo TCVN 13917-1:2023.

Để phát hiện sự kiện ngô chuyển gen MON 88017 các đường khuếch đại real-time PCR cần được kiểm tra trực quan về hình dạng chữ S để loại trừ các kết quả dương tính giả. Cần sử dụng chương trình phân tích dữ liệu cụ thể đối với máy chu trình nhiệt real-time tương ứng để nhận biết các sản phẩm PCR. Các kết quả khuếch đại có thể được biểu thị khác nhau, tùy thuộc vào thiết bị được sử dụng.

Trình tự đích sự kiện ngô chuyển gen MON 88017 được coi là phát hiện được nếu khi sử dụng real-time PCR đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MON 88017, có thể quan sát thấy đường cong khuếch đại hình chữ S và giá trị huỳnh quang xác định trước đã bị vượt quá ngưỡng.

Việc thiết lập các kiểm soát PCR không bổ sung ADN (kiểm soát thuốc thử PCR, kiểm soát chiết âm tính), không quan sát thấy đường cong khuếch đại hình chữ S và giá trị huỳnh quang xác định trước không bị vượt quá ngưỡng. Việc thiết lập các kiểm soát khuếch đại (kiểm soát ADN đích dương tính, kiểm soát ức chế PCR) thì thu được các giá trị dự kiến.

Trình tự đích sự kiện ngô chuyển gen MON 88017 được coi là không phát hiện, khi kết quả được biểu thị là “không xác định”, “không khuếch đại”, không quan sát thấy đường cong khuếch đại hình chữ S cho thấy không có sản phẩm PCR có thể phát hiện được. Hoặc giá trị huỳnh quang xác định trước không bị vượt quá ngưỡng là giá trị huỳnh quang mẫu chuẩn tương ứng.

Nếu dữ liệu đo huỳnh quang không điển hình thì việc diễn giải tự động không cho kết quả có nghĩa. Có thể cần thiết lập thủ công đường nền và ngưỡng trước khi diễn giải dữ liệu. Trong trường hợp này, áp dụng các hướng dẫn cho thiết bị cụ thể được cung cấp cùng phần mềm diễn giải.

Việc báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này; mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn hoặc những điều được coi là tự chọn và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

Kết quả thử nghiệm thu được tùy từng trường hợp cụ thể phải ghi kết quả mẫu âm tính: “Đối với mẫu A, không phát hiện được sự kiện ngô chuyển gen MON 88017”. Kết quả mẫu dương tính “Đối với mẫu A, phát hiện được sự kiện ngô chuyển gen MON 88017”. Kết quả định lượng “Đối với mẫu A, hàm lượng ADN có nguồn gốc từ sự kiện ngô chuyển gen MON 88017 là X + umeas %”, trong đó umeas là độ không đảm bảo đo.

 An Dương