TCVN 13850:2023 về da – xác định khả năng chống sự phát triển nấm mốc của da phèn xanh và trắng

Phèn xanh là tên gọi thông thường của muối đồng (II) sunfat (CuSO4). Là một chất rắn màu xanh lục, có tính tương đối tan trong nước. Hóa chất này thường được sử dụng trong xử lý nước để diệt khuẩn và tăng cường quá trình kết tủa các chất cặn trong nước. Nó cũng có thể được sử dụng trong một số ứng dụng khác như phân tích hóa học và một số quá trình điện hóa. Phèn xanh có tính kháng khuẩn và kháng nấm, do đó nó có thể được sử dụng làm chất bảo vệ cây trồng chống lại một số loại vi khuẩn và nấm gây hại.

Da phèn xanh là con da, hoặc da váng của con da to hoặc con da nhỏ, được thuộc bằng bazơ crom sulfat, độ ẩm khoảng 50 % và có độ pH axit. Da phèn trắng là con da, hoặc phần của con da, được thuộc bằng tác nhân thuộc da hữu cơ hoặc phi hữu cơ (không bao gồm tác nhân thuộc da chứa crom hoặc sắt và chất chiết xuất từ thực vật), độ ẩm khoảng 50 %.

Theo đó phạm vi áp dụng của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13850:2023 về da – xác định khả năng chống sự phát triển nấm mốc của da phèn xanh và da phèn trắng thì phương pháp thử tùy thuộc vào yêu cầu bảo quản và vận chuyển và được sử dụng trong sản xuất da.

Phương pháp thử này có thể không phù hợp để đánh giá thuốc diệt nấm bị bất hoạt bởi protein, bao gồm amoni clorua alkyldimethylbenzyl. Kết luận về khả năng chống lại sự phát triển của nấm mốc được suy từ kết quả bằng cách so sánh khi thực hiện đồng thời phép thử với mẫu đối chứng có khả năng chống chịu đã biết. Thành công hay thất bại được quyết định bởi mức độ phát triển của nấm mốc so với mẫu đối chứng.

Để các phòng thử nghiệm bất kỳ thực hiện được phương pháp thử này, cho phép linh hoạt về thời gian, nhiệt độ và độ ẩm của quá trình ủ, chất cấy, khu vực lấy mẫu da sống và lựa chọn điều kiện kiểm soát. Các yếu tố này có thể được điều chỉnh theo điều kiện riêng nhưng phải được chuẩn hóa. Các giá trị tính theo hệ đơn vị SI là giá trị tiêu chuẩn. Tiêu chuẩn này không sử dụng hệ đơn vị khác.

Xác định nấm mốc của da phèn xanh, da phèn trắng theo tiêu chuẩn vô cùng cần thiết. Ảnh minh họa

Tiêu chuẩn này không đề cập đến tất cả các vấn đề liên quan đến an toàn khi sử dụng. Người sử dụng tiêu chuẩn này có trách nhiệm thiết lập các nguyên tắc về an toàn và bảo vệ sức khỏe cũng như khả năng áp dụng phù hợp với các giới hạn quy định trước khi đưa vào sử dụng.

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đánh giá đặc tính chống lại sự phát triển của nấm mốc của da phèn xanh và da phèn trắng, đồng thời hỗ trợ dự đoán thời gian bảo quản trước khi xuất hiện nấm mốc. Mức độ tương quan giữa phép thử này và khối lượng thương mại của da phèn xanh và da phèn trắng trong các điều kiện bảo quản hoặc vận chuyển, hoặc cả hai, chưa được xác định đầy đủ.

Sự nhiễu phổ biến là sự nhiễm bẩn các đĩa, thạch hoặc mẫu do các sinh vật không mong muốn xâm nhập từ môi trường. Tính dễ bay hơi và khả năng tiếp cận của chất diệt khuẩn – “vùng ức chế” trong đó không có nấm mốc phát triển trên thạch tiếp giáp với mẫu thử cho thấy chất diệt nấm có thể bị khuếch tán.

Sử dụng thiết bị, dụng cụ như đĩa Petri, đường kính 120 mm. Tốt nhất nên sử dụng đĩa nhựa vô trùng dùng một lần. Tủ ẩm, hoặc vị trí có điều kiện tương tự, không có gió lùa và có khả năng duy trì nhiệt độ không đổi (±2 °C) trong khoảng từ 26 °C đến 30 °C. Dụng cụ nhỏ giọt thuốc, loại bằng nhựa dùng một lần, cung cấp 30 giọt đến 35 giọt/ml.

Thuốc thử và vật liệu gồm thạch dextrose khoai tây, môi trường cấy khô được sử dụng trong nuôi cấy nấm men và nấm mốc từ các sản phẩm sữa. Chất cấy, aspergillus niger 1 × 106 bào tử/ml, hoặc sinh vật khác hoặc tổ hợp các sinh vật bản địa trong khu vực bảo quản da phèn xanh và da phèn trắng.

Nên lấy mẫu thử từ các vị trí con da to tương đương (ví dụ vùng mông) cho cả mẫu thử và mẫu đối chứng. Nếu không thể thử ngay, phải lưu giữ các mẫu thử trong các túi nhựa riêng biệt và giữ mát. Mẫu thử phải là hình vuông, có cạnh 25,4 mm (1 in.). Sử dụng 3 mẫu thử cho mỗi đơn vị thử bề mặt da phèn xanh hoặc da phèn trắng để đánh giá.

Tiến hành thử bằng cách, dùng một mẫu thử da váng xẻ phèn xanh hoặc da váng xẻ phèn trắng yêu cầu khoảng 25 ml và dung dịch thạch và mẫu thử da không xẻ phèn xanh hoặc phèn trắng yêu cầu khoảng 40 ml. Tính số ml thạch cần thiết để thực hiện các phép thử, để 50 ml dung dịch thạch để kiểm tra sự sống. Sau đó cân 3,9g thạch khoai tây dextrose cho mỗi 100 ml thạch yêu cầu.

Rót một lượng nước tương đương với tổng số ml dung dịch thạch vào cốc có mỏ. Đun sôi nước trên bếp điện được trang bị cơ chế khuấy từ. Trong khi khuấy nên từ từ thêm thạch khô rồi tiếp tục đun sôi thạch trong 20 min. Lưu ý cần đậy bằng giấy nhôm để tránh nhiễm bẩn và để nguội đến 50 °C trước khi rót. Nhiệt độ này rất quan trọng, nhiệt độ 50 °C cho phép một ít nước ngưng tụ trên nắp đĩa petri (một loại đĩa được làm bằng thủy tinh hoặc chất dẻo có dạng hình trụ mà các nhà sinh vật học sử dụng để nuôi cấy tế bào hay những cây rêu nhỏ) cung cấp độ ẩm cho nấm phát triển. 

Chuẩn bị đĩa thạch bằng cách đặt một mẫu thử da phèn xanh và da phèn trắng vào giữa mỗi đĩa petri và để bề mặt cần thử quay lên trên. Cẩn thận nhấc nắp ra khỏi mỗi đĩa và đổ thạch chỉ đến bề mặt trên mẫu thử, không phủ lên bề mặt trên của mẫu thử. Chuẩn bị một đĩa chỉ có thạch (không có da phèn xanh) để đánh giá sự sống của chất cấy. Để thạch đông lại trong khoảng 20 min.

Khi cấy nên giảm số lượng 1 × 106 bào tử đang hoạt động cho 1ml xuống còn 1 × 105 bào tử cho 1ml bằng cách pha loãng thể tích bằng nước gấp mười lần. Sử dụng nước máy, mới được đun sôi trong 20 min và để nguội đến nhiệt độ phòng, để pha loãng. Chuẩn bị chỉ vừa đủ dung dịch huyền phù pha loãng để sử dụng trong khoảng thời gian 48 giờ. Giữ huyền phù sinh vật trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C. Không cấp đông.

Sử dụng pipet-một dụng cụ thí nghiệm để nhỏ giọt y tế nhỏ ba giọt bào từ 1 × 105 trên mỗi ml vào từng đĩa. Nhỏ trực tiếp một giọt lên mẫu và nhỏ hai giọt còn lại sang hai bên rồi để nguyên các đĩa khoảng 1 h. Ủ tối đa ba tuần ở nhiệt độ ổn định tại khu vực sạch sẽ, không bị xáo trộn. Giữ nhiệt độ ổn định quan trọng hơn nhiệt độ chính xác. Chấp nhận nhiệt độ thay đổi từ 26 °C đến 30 °C và không được thay đổi quá ± 2 °C.

Các mẫu thử da phèn xanh và da phèn trắng đối chứng có khả năng chống nấm mốc đã biết phải được thực hiện thử đồng thời cùng với các mẫu thử nghiệm. Phép thử thành công sẽ có ít nấm phát triển hơn so với phép thử đối chứng. Sau khi hoàn thành phép thử, các mẫu thử phải được khử trùng bằng nồi hấp. Nếu không, phải nấu trong 30 min trong nồi áp suất và thải bỏ vào thùng rác.

Sử dụng thang đánh giá từ 0 đến 4 trong đó mỗi số đại diện cho mức tăng trưởng quan sát được đặt trên mẫu thử (không phải trên thạch) ở bất kỳ khoảng thời gian nào đã chọn. Cụ thể 0 tương đương với không phát triển trên mẫu thử; 0,5: dưới 12 % bề mặt mẫu thử bị nấm mốc phát triển che phủ; 1; 25 % bề mặt mẫu bị nấm mốc phát triển che phủ; 2 là 50 % bề mặt bị nấm mốc phát triển che phủ; 3 là 75 % bề mặt mẫu thử bị nấm mốc phát triển che phủ và 4 là 100 % bề mặt mẫu thử bị nấm mốc phát triển che phủ.

Ngoài ra khi nấm mốc phát triển bên trên nhưng không chạm vào mẫu thử cũng sẽ được đánh giá bằng “0”. Thời gian đánh giá đề nghị là 3, 7 và 14 ngày.

Việc báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các nội dung xếp hạng của từng tấm mẫu thử; Kiểm tra bề mặt (mặt cật, mặt thịt, mặt váng). Thời gian ủ khi đánh giá; Chất cấy đã sử dụng; Vị trí con da từ đó lấy mẫu thử; Nhiệt độ ủ; Độ ẩm buồng ủ, nếu biết; Sự sống của chất cấy; Sai khác trong việc xử lý mẫu thử của phép thử và phép thử đối chứng; Độ chụm và độ chệch.

Độ chụm hoặc độ chệch của phương pháp thử này để đo khả năng chống lại sự phát triển nấm mốc của da phèn xanh và da phèn trắng là không xác định do kết quả chỉ cho biết liệu có sự phù hợp với các tiêu chí thành công được quy định trong cách tiến hành.

An Dương