Định danh nấm mốc bằng phương pháp quan sát hình thái và phương pháp khối phổ của Protein Ribosome

Nấm mốc là nhóm vi sinh vật đa dạng về mặt phân loại, bao gồm hơn 4000 loài có màu sắc, cấu trúc phong phú, độc đáo. Chúng thường mọc dưới dạng sợi nhỏ đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae), sinh sản bằng cách tự phân đôi tạo ra các bào tử. Điều kiện thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc là môi trường ẩm ướt, kém vệ sinh với khoảng nhiệt độ tối ưu từ (21- 32)oC. Tuy nhiên, một số loài mốc có thể sinh trưởng từ (0 – 50) oC và cũng có loài chịu được điều kiện khô hạn (Christensen, 1965).

Nấm mốc trong môi trường sống và thực phẩm đều có thể gây ảnh hưởng lớn tới sức khỏe của con người. Năm 2004, Viện Y học (Institute of Medicine, IOM) đã chứng minh có sự liên quan việc tiếp xúc trong nhà với nấm mốc với các triệu chứng đường hô hấp trên, ho và thở khò khè ngay cả trên những những người khỏe mạnh bình thường.

Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy mối liên kết tiềm tàng của việc tiếp xúc với nấm mốc trong giai đoạn đầu với sự phát triển bệnh hen suyễn, viêm phổi ở một số trẻ em. Ngoài ra, việc tiêu thụ các loại thực phẩm nhiễm mốc cũng gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ con người, đặc biệt các loại mốc có khả năng sản sinh ra độc tố họ mycotoxin, khi tiếp xúc với độc tố này ở nồng độ cao có thể dẫn đến các vấn đề về thần kinh, thậm chí có thể gây tử vong.

Do tác hại của nấm mốc đến chất lượng thực phẩm cũng như sức khoẻ con người, vật nuôi, vấn đề kiểm soát nấm mốc ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Năm 2009, Tổ chức Y tế Thế giới đã ban hành hướng dẫn bổ sung về chất lượng không khí trong nhà liên quan đến độ ẩm và nấm mốc (WHO Guidelines for Indoor Air Quality: Dampness and Mould).

Chính phủ Việt Nam cũng ban hành rất nhiều quy chuẩn quy định về giới hạn ô nhiễm nấm mốc trong chất lượng không khí trong nhà và những nhóm sản phẩm như thực phẩm, thực phẩm chức năng, phụ gia thực phẩm, nước và ngay cả các sản phẩm mỹ phẩm, hàng tiêu dùng,… Để đáp ứng nhu cầu kiểm soát trên, các phương pháp định lượng men mốc theo tiêu chuẩn quốc tế (ISO, AOAC, FDA,…) cũng như tiêu chuẩn quốc gia (TCVN, QCVN) đã được xây dựng và áp dụng rộng rãi trong hầu hết các phòng thí nghiệm.

Hình 1.1. Quan sát hình thái nấm mốc trên kính hiển vi;

Hình 1.2. Đặc điểm hình thái của một số loại nấm mốc trên môi trường phân lập và dưới kính hiển vi (độ phóng đại 40X). Trong đó: 

(1.2a) Khuẩn lạc Aspergillus flavus_oryzae_group trên môi trường DG18: khuẩn lạc màu xanh dưa cải. Trên kính hiển vi, quan sát được nấm có bọng hình cầu, thể bình 1 hoặc 2 tầng, bào tử đính, hình tròn.

(1.2b) Khuẩn lạc Fusarium sp. trên môi trường DG18: Khuẩn lạc mặt hơi bông, màu trắng hồng. Quan sát được bào tử to, có hình lưỡi liềm đặc trưng trên kính hiển vi.

(1.2c) Khuẩn lạc Rhizopus sp. trên môi trường DRBC: Khuẩn lạc màu trắng, mặt khóm như len. Quan sát được bào tử túi và rễ giả trên kính hiển vi.

Hiện nay, ngày càng có nhiều nhà máy sản xuất rơi vào tình trạng nhiễm vi sinh trong sản phẩm cũng như nhà xưởng, đặc biệt là nhiễm nấm mốc. Vấn đề càng trở nên đáng lo ngại với một quốc gia có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm như Việt Nam do đây là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển nấm mốc.

Do nấm mốc rất đa dạng về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá nên việc loại bỏ các loài nấm mốc khác nhau cần có biện pháp xử lý khác nhau. Để có thể chủ động hơn trong việc kiểm soát môi trường sản xuất, điều tra nguyên nhân nhiễm mốc và có biện pháp xử lý phù hợp, bên cạnh việc định lượng nấm mốc theo các tiêu chuẩn hiện hành, ngày càng nhiều doanh nghiệp quan tâm, chú trọng đến việc định danh để xác định đến chi hoặc loài nấm mốc.

Để giải quyết vấn đề trên, Phòng Thử nghiệm Vi sinh – GMO thuộc Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 (QUATEST 3) đã xây dựng và phát triển phương pháp định danh nấm mốc dựa trên việc quan sát hình thái trên kính hiển vi, qua đó có thể quan sát rõ cấu trúc sợi, hình thái bào tử và các cấu trúc điển hình khác của các loại nấm mốc khác nhau. Phương pháp được phát triển dựa trên những nghiên cứu về hệ nấm mốc ở Việt Nam của TS. Đặng Thị Hồng Miên, tài liệu nghiên cứu nấm và nấm gây hư hỏng thực phẩm của J.I.Pitt và A.D.Hocking.

Ngoài ra, phòng thử nghiệm cũng sớm nghiên cứu và phát triển phương pháp định danh nấm mốc dựa vào khối phổ của protein ribosome sử dụng kỹ thuật ion hoá laser kết hợp khối phổ thời gian bay (MALDI TOF MS) trên thiết bị Bruker MALDI Biotyper theo nguyên tắc phương pháp AOAC 2017.09, AOAC 2017.10 và MBT Filamentous Fungi Module. Đây là phương pháp sử dụng công nghệ hiện đại giúp định danh vi sinh vật bằng dấu ấn phân tử dựa trên sự so sánh độ tương đồng khối phổ protein ribosome của vi sinh vật mục tiêu với cơ sở dữ liệu khối phổ vi sinh vật chuẩn.

Phương pháp này có nhiều ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống như: kết quả định danh chính xác đến loài hoặc chi, thời gian thử nghiệm nhanh (khoảng 15-30 phút) sau khi phân lâp được khuẩn lạc, kĩ thuật thực hiện đơn giản, kết quả không bị ảnh hưởng bởi các loại môi trường nuôi cấy khác nhau.

Hình 2.1: Thao tác định danh nấm mốc trên thiết bị Bruker MALDI Biotyper Hình 2.2 Kết quả định danh một số mẫu nấm mốc phân lập từ thực phẩm và môi trường sử dụng kỹ thuật MALDI TOF MS Hình 2.3: Khối phổ protein đặc trưng của nấm mốc Penicillium citrinum

Hai phương pháp trên đều có độ tin cậy cao, các thông số về độ chọn lọc mục tiêu, độ chọn lọc loại trừ được đều đáp ứng yêu cầu kỹ thuật và thoả mãn yêu cầu về lựa chọn phương pháp thử phù hợp mục đích sử dụng của khách hàng. Với việc áp dụng 2 phương pháp trên, thời gian qua, Trung tâm Kỹ thuật 3 đã và đang tiếp tục đồng hành cùng rất nhiều doanh nghiệp trong quá trình kiểm soát môi trường sản xuất, nghiên cứu sự đa dạng nấm mốc trong mẫu, xác định nguyên nhân hư hỏng, biến tính sản phẩm, nguyên nhân ngộ độc thực phẩm,… nhằm đưa ra các biện pháp xử lý hợp lý, kịp thời.

Trần Thị Ánh Nguyệt – Vũ Diệu Thu